纳米尺度蛋白质分析

Tau蛋白作为一种微管稳定因子而广为人知[1]。这种微管相关蛋白（MAP）特异性表达于神经元中，主要定位于轴突远端区域。Tau蛋白的过度磷酸化会降低其与微管的亲和力，导致其聚集成配对螺旋纤维（PHFs）和神经原纤维缠结（NFTs），从而改变突触连接并引发神经退行性病变。Tau蛋白的聚集与高度磷酸化是阿尔茨海默病（AD）中细胞死亡的神经毒性标志。尽管空间分辨率有限，但研究表明通过FTIR方法检测1070 cm⁻¹附近的磷酸基团红外吸收峰，可实现磷酸化修饰的识别[2]。本应用说明将采用IR PiFM化学成像技术，对转基因阿尔茨海默病小鼠脑切片中Tau蛋白的纳米尺度聚集行为进行可视化研究。

图1展示了来自TG样本（阿尔茨海默病模型）的三组PiF-IR光谱（浅绿、蓝、紫色）及对照组（非阿尔茨海默病）的PiF-IR光谱；插图为脑切片AFM形貌图，并标注光谱采集位点。TG样本的浅绿与蓝色光谱与对照组光谱相似，均显示显著的酰胺I带（1660 cm⁻¹）与酰胺II带（1550 cm⁻¹）特征峰，以及较弱强度的1740 cm⁻¹（脂质酯基C=O伸缩振动）、1243 cm⁻¹（磷脂PO₂⁻不对称伸缩振动）和1065 cm⁻¹（磷脂对称伸缩振动）特征峰。在TG样本类聚集体特征处采集的紫色PiF-IR光谱显示1740、1243及1065 cm⁻¹处峰强度显著增强，而酰胺峰强度减弱。图2展示了1744 cm⁻¹与1060 cm⁻¹波数采集的PiFM图像及同区域AFM形貌图。可见两幅PiFM图像凸显相同特征结构，该现象很可能源于磷酸化修饰；需注意纳米尺度特征在兩幅图像中均得到良好重现。目前难以判断PiFM特征是否与形貌特征存在关联性。

图3展示了分别通过酰胺I带（红色，1650 cm⁻¹）标记周围组织、磷酸基团对称伸缩振动（绿色，1740 cm⁻¹）标记磷酸化蛋白的TG与对照样本形貌及PiFM图像。两样本AFM形貌高度相似，均呈现高达数微米的高度起伏特征。同样，1650 cm⁻¹波数PiFM图像显示的周围组织特征也极为相似。然而，1740 cm⁻¹波数显示的磷酸化蛋白聚集态图像则呈现显著差异：对照样本中两波数图像基本重合，表明脂质均匀分布于组织中；而阿尔茨海默病样本的1740 cm⁻¹图像不仅显示脂质/组织背景（在形貌起伏较小的中上部区域最清晰），还显现出遍布组织的大量聚集体——我们将其归因于磷酸化修饰。

自组装蛋白笼

自组装蛋白可作为”智能”生物材料的构建单元，充分利用蛋白质丰富的结构与功能特性。该领域已设计出诸如二十面体蛋白笼等新型自组装结构。由于二十面体蛋白笼能封装大体积物质，常被用于疫苗设计与靶向药物递送。

图4比较了三种不同放大倍数（扫描尺寸）的PiFM图像与单个自组装二十面体蛋白笼的SEM图像。PiFM图像通过分次扫描采集以验证其特殊形状（非完全圆形）与内部信号对比度的可重复性。PiFM图像显示的尺寸与类六边形轮廓与同放大倍数的SEM图像高度吻合（图像按等比例尺显示）。PiFM图像显示笼内对比度差异，暗示不同晶面存在——其棱与面表现出不同的酰胺I带（1666 cm⁻¹）信号强度；由于激发光主要沿针轴方向偏振，该图像显示了酰胺I带的偏振依赖性响应。PiFM图像旁附二十面体笼示意图，以标注图像中暗示的晶面结构。更多细节参见文献[3]。

参考文献

1. Cell Biochem Funct. 2020, 38, 686–694
2. “FT-IR analysis of phosphorylated protein,” Proc. SPIE 5461, Biophotonics New Frontier: From Genome to Proteome, (8 September 2004)
3. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 23, 9207-9216